白细胞分离：（加速红细胞沉降法）
更新时间：2014-01-21 7808
| 加速红细胞沉降法 利用高分子量的聚合物促使红细胞凝聚成串钱状，从而加速红细胞沉降，使 | |||||||||
| 之与白细胞分离。 | |||||||||
| 常用的高分子聚合物有明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及甲基纤维素等。 | |||||||||
| （1） 试剂及配制 | |||||||||
| 3%明胶（灏洋生物产）（粘度为25泊以上）：选取明胶，用生理盐水配成3%溶液，置沸水 | |||||||||
| 浴加热溶解，分装，高压蒸汽灭 | |||||||||
| 菌8磅15-20min. | |||||||||
| 6%右旋糖酐（灏洋生物产）（分子量200-400KD）：用生理盐水配制。 | |||||||||
| 操作方法分为2种。 | |||||||||
| *种：①取抗凝静脉血加入等量3%明胶盐水溶液中，混匀或用3份血液与1份3%明胶溶液混 | |||||||||
| 匀；②将试管直 | |||||||||
| 立静置室温或37℃温箱中30-60min,利用明胶与红细胞的粘合作用，促使红细胞快速下沉，而白 | |||||||||
| 细胞留在明胶溶液 | |||||||||
| 中；③用毛细吸管吸取富含白细胞的上层液，移入另一试管中；④按自然沉降法④-⑤操作。 | |||||||||
| 第二种：①取1份右旋糖酐溶液加等量抗凝血，混匀；②按操作方法1的②-④操作。 | |||||||||
| 外周血单个核细胞分离试剂：（聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法） | |||||||||
| 外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同， | |||||||||
| 红细胞和多核 | |||||||||
| 细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重1.077左右的分 | |||||||||
| 层液作密度梯度 | |||||||||
| 离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 | |||||||||
| 1．试剂及配制 | |||||||||
| ⑴聚蔗糖泛影葡胺分层液（LTS1077）：（灏洋生物有成品供应），比重为1.077±0.001 | |||||||||
| ⑵台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml ,1500r/min离心 | |||||||||
| 15min,吸出上层液， | |||||||||
| 即为4%水溶液。用前，1.8%氯化钠溶液1倍，即为2%台盼蓝染液。 | |||||||||
| 2.操作方法 | |||||||||
| ⑴取静脉血放入抗凝管，摇允，用Ph7.2-7.6 Hank 液稀释血液1-2倍。 | |||||||||
| ⑵取LTS1077聚蔗糖-泛影葡胺分层液（灏洋生物产）3-4ml,放入15X150mm试管中。 | |||||||||
| ⑶用毛吸管吸取稀释血液，在离分层液上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液 | |||||||||
| 上，稀释血液与 | |||||||||
| 分层液体积比例约为2：1。 | |||||||||
| ⑷用水平离心机以2000r/min离心30min,离心后管内容物分为三层，上层为血浆（内含血小板）， | |||||||||
| 中间层为分层液， | |||||||||
| 底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层。 | |||||||||
| ⑸用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一试管中。 | |||||||||
| ⑹加5倍以上体积不含Ca2+、Mg2+Hank液，混匀，1500r/min离心10min,吸弃上清，重复洗涤2次。 | |||||||||
| ⑺末次离心后，吸尽上清。按每毫升血液标本加0.2ml含20%小牛血清Hank液重新混悬细胞。取1 | |||||||||
| 滴细胞悬液置血 | |||||||||
| 6 | |||||||||
| 球计数板内计数。然后细胞浓度调节至2X10 /ml | |||||||||
| ⑻细胞活力检测：取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检。活细胞 | |||||||||
| 不着色，折光强； | |||||||||
| 死细胞被染成蓝色，体积略膨大。活细胞数应在95%以上。 | |||||||||
| 3．注意事项 | |||||||||
| ⑴用稀释后的全血可是单个核细胞得率高，将稀释的血液叠加于分层液上时，一定要细心，动作 | |||||||||
| 要轻，避免冲散 | |||||||||
| 分层液面或与分层液混合而影响分离结果。 | |||||||||
| ⑵配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，具缓冲作用，并对细胞无毒性。 | |||||||||
| ⑶吸取单个核细胞时，应避免吸出过多上清液或分层液而导致血小板污染。 | |||||||||
| ⑷配制好的单个核细胞可放室温或0-4℃，后一条件较好，可减低细胞代谢活动。注意不要迅速 | |||||||||
| 改变其所出的温 | |||||||||
| 度，以免造成“温度”休克。 | |||||||||
| 通用型细胞分离液（LTS1130） 的比重的配方（灏洋生物产） | |||||||||
| 取比重LTS1077的人淋巴细胞分离液（灏洋生物产） 3ml ,放入15X150mm试管中。 | |||||||||
| 用PBS将肝素抗凝血稀释1-2倍后，将稀释全血加到LTS1077分离液上，稀释的血液：分离液约为 | |||||||||
| 2：1。 | |||||||||
| 用水平离心机以1500r/min离心10min,离心后，单个核细胞位于血浆和分离液的界面层，红细胞和 | |||||||||
| 粒细胞沉淀在 | |||||||||
| 分离液层下，一部分单核细胞和血小板位于分离液层上。 | |||||||||
| 吸取界面单个核细胞层，用PBS洗三次。 | |||||||||
| 用适当的培养液重叠单个核细胞，配成所需浓度的细胞。 | |||||||||
| 用台盼蓝拒染法检查细胞活力。 | |||||||||
| NK细胞分离试剂：细胞分离液不连续梯度分离法 | |||||||||
| 通用型细胞（LTS1130）分离液，为无毒、无刺激的新型密度梯度离心分离剂。其在离 | |||||||||
| 心过程中会自然 | |||||||||
| 形成密度梯度，从而将不同密度的细胞分离出来。 | |||||||||
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