biomiga 快速过滤法质粒超大量提取试剂盒

1. 质粒拷贝数：纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,C1,100%乙醇，相同体积的Wash Buffer （70% 乙醇）和Elution Buffer.
2. 转化菌：若为-70^oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。
3. 柱结合能力：6 mg

1. 取500 µL新鲜的菌液接种到 800-1000 mL （勿超过 1,000 mL）的LB培养基（含适量抗生素），37^oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
2. 加入60 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。
3. 加入 60 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。 
4. 加入 72 mL Buffer C1,立即反转几次至出现絮状白色沉淀。涡漩震荡10 秒。充分混匀后，溶液将会变得颜色均一，如果此时溶液颜色不均一，均局部颜色过深，建议将溶液轻甩几次，以充分混合溶液，室温下静置10分钟。
5. 将双层Filter unit与500 mL或1000 mL的灭菌瓶（Corning# 430518 or 430282 or equivalent） 连接，旋紧，再将此装置与真空负压装置连接。
6. 先将步骤“5”中底部较澄清的裂解产物用50 mL移液管转移至双层Filter unit中，静置5分钟后打开真空装置，使负压由低到高，5分钟后增至zui大（0.04 Mpa）。
7. 当大部分裂解液已被过滤时，关掉真空负压装置，等候1分种，拆卸装置，移去双层Filter unit。
8. 再将DNA unit杯与一个新的灭菌的500ml或1000ml螺口标准瓶连接，旋紧。并将过滤嘴与真空负压装置连接。将步骤“7”中收集到的裂解液中加入72 mL 100%乙醇，立即混合均匀，立即将一半倒入DNA unit杯中，开启负压装置，进行过滤吸附操作。
9. 再将剩下一半倒入DNA unit杯中，当所有裂解液已过滤完，再维持真空1分钟后，关掉负压装置。
10. 在DNA Unit杯中加入50 mL Buffer KB，开启负压装置至zui大（0.04Mpa）并维持1分钟，使Buffer KB*通过DNA Unit杯。
11. 在DNA Unit杯中加入50 mL 70%乙醇，开启负压装置至zui大（0.04Mpa）并维持1分钟，使乙醇*通过DNA Unit杯。重复此操作步骤一次。
12. 在DNA Unit杯中加入60 mL100%乙醇，开启zui大负压维持1分钟，关掉负压装置，倒掉瓶子中的废液，将DNA Unit杯重新连接至标准瓶上，开启负压装置至zui大负压，真空抽20分钟，以充分去除残留的乙醇。
13. 关掉负压装置，静置一分钟，移去标准瓶，将DNA Unit 连接至一个新的50 mL的离心管中，并旋紧。
14. 加入10 mL 灭菌 ddH2O或者Elution Buffer到DNA Unit杯的膜上，室温放置2分钟，打开负压装置至zui大（0.04 Mpa）洗脱DNA。此时会收集到3~5 mＬ洗脱液，这是1^st 洗脱液。
15. 关掉负压装置，将DNA Unit连接至一个新的50mL的离心管中，加入8 mL 灭菌 ddH2O或者Elution Buffer到DNA Unit杯的膜上，室温静置2分钟，开启负压装置至zui大（0.04 Mpa）洗脱DNA。此时会收集到约5-6 mL洗脱液，这是2^nd洗脱液。

操作流程：