| 从15～50 mL菌液中纯化200 μg无内毒素质粒DNA 试剂盒组分： | Catalog # | PD1415-01 | | Preps | 10 | | EzBindTM Columns | 10 | | Buffer A1 | 30 mL | | Buffer B1 | 30 mL | | Buffer N3 | 40 mL | | Buffer KB | 35 mL | | EndoClean Buffer | 10 mL | | RNase A （20 mg/mL） | 3 mg（150 μL） | | Endofree Eluiton Buffer | 15 mL | | User Manual | 1 | 保存条件： RNAse A在4℃下可以保存一年，Buffer A1加入RNase A 后4℃保存，其它组分室温保存。 注意事项： - 质粒拷贝数：纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇，相同体积的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer.
- 转化菌: 若为-70oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。
- 切勿直接取冻存在4oC的菌进行培养。
- 柱结合能力：250 μg
- 对富含内源核酸酶的宿主菌（endA＋）如HB101, JM101, TG1等，需去核酸酶，请使用产品PD1712。
操作简明步骤： - 取50 µL新鲜的菌液接种到15-50 mL （勿超过 50 mL）的LB培养基（含适量抗生素），37oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
- 加入2.5 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。
- 加入 2.5 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。
- 加入600 µL Buffer N3, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
- 将离心管转至高速离心机，在室温下13,000 x g 离心10分钟（若上清中有白色沉淀，可再次离心）。
- 定量吸取离心后的上清液至新的15 mL管中（避免吸起沉淀），加入0.1 倍体积的EndoClean Buffer，混匀后冰浴10分钟，其间不时摇匀（若EndoClean Buffer粘稠难吸，可将枪头剪掉头后再吸取）。
- 室温下（冰浴取出后务必使溶液温度恢复到23oC以上，否则溶液不分层）13,000 x g离心10分钟（也可在2,500 x g离心15 分钟）。此时溶液分为两层，上层水相含有质粒，下层红色有机相含有内毒素。
- 将上层水相转移至一个新的15 mL管中，加入3 mL的Buffer N3及3 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混匀，该混合溶液需要需马上进行过柱吸附操作。
- 立即转移6.0 mL裂解液至带收集管的DNA柱中，室温下> 2,500 x g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。
- 可选: 向DNA柱中加入 3.0 mL Buffer KB, 室温下> 2,500 x g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。
- 向离心柱中加入5 mL 70% 乙醇，室温下> 2,500 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“11”。
- 将离心柱放回高速离心机中，室温下> 2,500 x g开盖离心10分钟，以*去除残留的乙醇。
- 将离心柱转至一个新的15 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入0.5 mL的Endofree Elution Buffer，室温放置1分钟，> 2,500 x g 离心5分钟，以洗脱质粒DNA。若想提高得率，可用洗脱得到的0.5 mL的Endofree Elution Buffer再洗脱一次，收集到新的离心管中。
操作流程：  |
更新时间：2013-01-06 
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