无内毒素快速质粒中量提取试剂盒

RNAse A在4℃下可以保存一年，Buffer A1加入RNase A 后4℃保存，其它组分室温保存。

注意事项：

1.       质粒拷贝数: 纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1, B1, N3, RET, 100% ethonal 相同体积的DNA Wash Buffer和Endofree Elution Buffer.

2.       转化菌: 若为-70^oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。

3.       切勿直接取冻存的菌进行培养。

操作简明步骤：

1.       取50 µL新鲜的菌液接种到15-50 mL （勿超过 50 mL）的LB培养基（含适量抗生素），37^oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。

2.       加入2.5 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。

3.       加入2.5 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。 

4.       加入1 mL Buffer N3， 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。

5.       将裂解液转移至高速离心管，室温下在12,000 x g 离心10分钟。

6.       转移上清液5 mL，向裂解液中加入1倍体积的Buffer RET （即每5 mL裂解液加入5 mL Buffer RET）,及3 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混匀，需马上离心过DNA柱。

7.       立即转移6 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中，室温下5,000 x g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。

8.       可选：向离心柱中加入5 mL Buffer KB，室温下5,000 x g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。

9.       向离心柱中加入5 mL 70% 乙醇，室温下5,000 x g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“9”。

10.    将离心柱放回高速离心机中，室温下5,000 x g开盖离心10分钟，以*去除残留的乙醇。

11.    将离心柱转至一个新的15 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入1 mL 的Endofree Elution Buffer, 室温放置1分钟，5,000 x g 离心5分钟，以洗脱质粒DNA。

12.    将15 mL离心管中的洗脱液上柱再放置洗脱1分钟，5,000 x g 离心5分钟。 两次洗脱将提高得率。

操作流程：