无内毒素快速质粒大量提取试剂盒 操作流程

1.   取100 µL新鲜的菌液接种到150-200 mL （勿超过 200 mL）的LB培养基（含适量抗生素），37^oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。注：残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分，离心后沉淀较松，不能有效吸取上清。注：本说明书中的操作程序适用于标准LB （Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，OD₆₀₀（细菌密度）在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基，例如TB 或2×YT，请注意保证OD₆₀₀不超过3.0。

2.   加入10 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。 注：不*悬浮易导致菌体裂解不*，从而使产量降低。

3.   加入 10 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。  注：切勿剧烈振荡。静置时间不应超过5分钟，时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到破坏。若溶液未清亮澄清，则表明菌体裂解不充分，应加大Buffer B1的用量或减少菌体量。

4.   加入3 mL Buffer N3, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。

5.   将离心管转至高速离心机，在室温下12,000 x g离心10分钟（若上清中有白色沉淀，可再次离心）。注：低温下RNase不工作，易有RNA污染。如果离心机转子较冷，将离心管在室温下温育10分钟后再离心。若无告速离心机，可用Syringe filter替代（在PD1522中提供，也可单独购买）。

6.   转移上清液20 mL（不超过20 mL）至新的50mL离心管中，加入0.5倍体积的Buffer RET （即每20 mL裂解液加入10 mL Buffer RET） 及10 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混匀，需马上离心过DNA柱。

7.   立即转移20 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中，室温下> 2,500 x g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。将剩余溶液转移至DNA柱中，室温下> 2,500 x g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复直至所有的溶液通过DNA柱。注：如果50 mL的收集管与离心机转子不符，可在台式离心机> 2,500 x g 离心2分钟。

8.   向离心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室温下> 2,500 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“9”。

9.将离心柱放回高速离心机中，室温下5,000 x g开盖离心10分钟，以*去除残留的乙醇。注：此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇，乙醇是否去除干净将会影响zui后的洗脱效率。若转速低于5,000 x g，需离心20分钟，并可放在空气中晾干。

10.将离心柱转至一个新的50 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入1-1.5 mL 的Endofree Elution Buffer，室温放置1分钟，> 2,500 x g离心5分钟，以洗脱质粒DNA。将50 mL离心管中的洗脱液上柱再放置洗脱1分钟，> 2,500 x g离心5分钟。 两次洗脱将提高得率。注：提取到的质粒DNA可用于转染内毒素敏感性细胞株，原代细胞及用于微注射，建议去除内毒素。

操作流程：